干細胞來源的肝細胞：前景廣闊的研究HBV感染的新工具
乙型肝炎病毒（HBV）感染常導致肝硬化和肝細胞癌，是引起進行性肝臟疾病的主要病因。遺傳特征研究發(fā)現(xiàn)，HBV的復制周期特異性地依賴于宿主物種類型及其肝細胞。盡管用克隆的病毒基因組轉染肝腫瘤來源的細胞系后可實現(xiàn)HBV復制和病毒顆粒組裝，然而只有在人原代肝細胞(PHH)或樹鼩原代肝細胞內(nèi)才能獲得完整的全病毒復制周期，包括通過受體介導的病毒穿入、將核殼體轉送至細胞核、rcDNA修復和cccDNA的形成。直到2002年Gripon等先獲得HBV易感細胞系，他們從一名HCV感染患者的肝臟中培養(yǎng)出肝祖細胞系(HepaRG)，再經(jīng)特定的培養(yǎng)條件分化后獲得HBV的易感性。該培養(yǎng)條件包括一個為期四周的分化過程，終獲得膽管樣細胞和肝樣細胞(HLC)。后者和PHH相似，表達肝細胞特異的標記物，如細胞色素P450和人白蛋白等。HepaRG細胞分化后對HBV具有易感性，說明分化的細胞表達了HBV受體，但當時并不清楚HBV受體是什么。十年之后，北京的李文輝小組發(fā)現(xiàn)鈉-?；悄懰猁}共轉運多肽(NTCP)正是長期以來一直在探索的HBV受體，HepaRG細胞分化后也確實誘導了NTCP的表達。
另一條探索獲得HBV易感細胞系的途徑是對不同來源的干細胞進行分化，從而獲得HLC，如人類胚胎干細胞(hESC)、肝祖細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞等。利用hESC獲得HLC的方案通常包括三個關鍵步驟：(1)誘導內(nèi)胚層的生成，(2)肝細胞定向分化，(3)肝細胞成熟。2006年，Yamanaka及其同事通過將Oct3/4、Sox2、c-Myc以及Klf4這四個轉錄因子導入小鼠成纖維細胞而獲得了多能干細胞，這些重編程的誘導性多能干細胞(iPSC)可以分化為HLC。隨后出現(xiàn)了很多的優(yōu)化方案，這些方案均遵循一些相似的原則。簡而言之，先通過激活素A和Wnt3a來誘導生成內(nèi)胚層，這一過程可通過免疫熒光法(IF)檢測轉錄因子SOX17、FOXA2和GATA4進行評估；其次，通過成纖維細胞生長因子或化學制劑二甲基亞砜(DMSO）來誘導肝母細胞的形成，后者也可用于誘導HepaRG細胞的易感性，這一過程通過肝細胞核因子4(HNF4α)、細胞角蛋白19(CK19)、甲胎蛋白(AFP)和上皮細胞粘附分子(EPCAM)的表達進行監(jiān)測；后，在含有肝細胞生長因子和抑瘤素M的培養(yǎng)條件下將肝母細胞向成熟肝細胞分化，該過程往往伴有脫唾液酸糖蛋白受體(ASGR)、白蛋白、細胞角蛋白18(CK18)和CYP3A4的表達。成熟HLC還具備尿素生成、吲哚菁綠(ICG)攝取和糖原存儲等肝細胞功能。此外，將HLC移植入動物模型后可促進肝功能的恢復。目前沒有將HBV的易感性作為評價HLC功能的標準。
在之前進行的一項研究中，Shlomai等次證明HBV可以感染iPSC來源的HLC。該研究表明，在肝細胞成熟過程中，存在明顯誘導的NTCP表達，從而獲得對HBV的易感性，提示人iPSC來源的HLC可以應用于HBV生物學研究。重要的是，該研究為從某些患者群體以及具有某種遺傳多態(tài)性的個體中獲得具有HBV易感性的細胞提供了研究方向。
美國國立衛(wèi)生研究院的Jake Liang 等利用人ESC來源和人iPSC來源的HLC建立了有效可控的HBV體外模型，證實和拓展了上述發(fā)現(xiàn)。該小組利用他們之前建立的分化方案，在重編程的過程中對已知的肝細胞標記物，如維甲酸X受體(RXR)、HNF4α和NTCP受體的表達進行動態(tài)分析,發(fā)現(xiàn)所有相關標記物都存在誘導性表達。而且，與PHH和HepaRG細胞相比，干細胞來源的HLC中誘導性NTCP表達水平更高。此外，在對PHH進行單層細胞培養(yǎng)時其NTCP迅速消失，而干細胞來源的HLC中NTCP的存在時間更長。這一發(fā)現(xiàn)尤其重要，因為這是長期培養(yǎng)時病毒可以進行傳播的先決條件。研究人員還確認在HBV感染后，觀察到cccDNA生成、病毒RNA表達、HBsAg和HBeAg分泌以及病毒增殖等。根據(jù)細胞內(nèi)HBsAg染色結果，當使用300基因組當量（mge）HBV時，約30%的干細胞來源的HLC可被病毒感染。與之前觀察到的PHH和HepaRG細胞以及表達NTCP的HepG2-NTCP相比，這種感染率頗為“低效”。然而，當病毒負荷增加至1000 mge時，細胞感染率幾乎增加至100%。這一表現(xiàn)與PHH相似，且所有HLC亞群均有易感性。然而，HepaRG細胞在分化后有50%為不具有易感性的膽管細胞，且只有一個肝細胞亞群可被感染。因此，.0需要較高的病毒負荷來獲得高乙型肝炎病毒感染率未必是某一特定體外感染系統(tǒng)的缺陷，可能在一個擴散速度有限的二維細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，將病毒從未成熟的形式轉化為可以結合NTCP的形式是一個較慢的過程（見表1）。
+號數(shù)代表抗原水平：++++，非常高；+++，高；++，中等；+，低；±，非常低。
評價欄：（+）和（-）分別代表正面和負面評價，（±）代表中立
Ni Y等一個重要發(fā)現(xiàn)是在終分化完成后HLC的易感性可持續(xù)達4周，這和PHH形成鮮明的對比。這一發(fā)現(xiàn)鼓勵了作者繼續(xù)研究如果培養(yǎng)時間足夠長，允許HBV在感染后進行多個周期的增殖，HLC是否可支持子代病毒的傳播。HBV病毒包膜源性抑制劑myrcludex B可干擾NTCP介導的HBV感染，作者通過長期使用該抑制劑證實當病毒侵入肝細胞的通路被阻塞后，該培養(yǎng)體系中病毒標記物水平會顯著降低。此外，他們還采用免疫化學方法證實抑制劑可阻止鄰近感染細胞群的形成。目前尚未在其它細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)類似結果，該發(fā)現(xiàn)與移植PHH的uPA/SCID小鼠體內(nèi)試驗數(shù)據(jù)一致。值得注意的是，在培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)這種低水平的病毒傳播仍不足以達到對導入病毒進行凈擴增的要求。這與鴨HBV感染模型的結果明顯不同，在鴨原代肝細胞中可觀察到病毒凈擴增。這可能反映了兩種病毒的侵入通路有明顯差別。因此，在未來的研究中很有必要將HLC置于三維培養(yǎng)環(huán)境中來觀察病毒傳播的水平是否增加。
為評估HLC是否適用于研究病毒-宿主相互作用以及藥物篩選，作者用siRNA先后沉默兩個已知的宿主因素NTCP和APOBEC3B，發(fā)現(xiàn)沉默關鍵宿主依賴因子NTCP使細胞易感性降低了2倍，而沉默宿主抑制因子APOBEC3B使HBV復制增加了約1.5倍。后，作者對HLC是否適合用于高通量藥物篩選進行了研究，終篩出兩個潛在的抗病毒藥物，染料木黃酮和RXR拮抗劑PA452。
以上對hiPSC或hESC來源的HLC進行應用探索，為未來針對HBV復制周期的研究提供了非常重要的新型工具。為了將體外培養(yǎng)系統(tǒng)改善為更類似于肝臟自然狀態(tài)（類器官、三維培養(yǎng)、生物反應器），很重要的一個方面是通過研究HLC的應用來取代PHH，后者來源有限。后，對于直接修改干細胞系基因的研究進展將對特異性宿主因素的研究產(chǎn)生深遠影響，如從具有已知某種多態(tài)性或遺傳疾病的成人成纖維細胞中制備iPSC，將其轉化為個體特異的HLC，并用于乙肝病毒研究。
